Είναι ένα Gram-θετικό βακτήριο που παράγει μεγάλο αριθμό τοξινών, μεταξύ των οποίων την εντεροτοξίνη Α και την κυτταροτοξίνη Β. Το C. difficile είναι ένα βακτήριο που βρίσκεται στο περιβάλλον, τον αέρα, το νερό, τα κόπρανα ανθρώπων και ζώων, και τα τρόφιμα, όπως το κατεργασμένο κρέας. Το C. difficile παράγει σπόρους, που μπορούν να διατηρηθούν στο περιβάλλον εβδομάδες έως και μήνες, με αποτέλεσμα την επαφή και την μόλυνση μας.
Το C. difficile απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1935, αλλά μόλις το 1975 ταυτοποιήθηκε ως παθογόνο αίτιο διάρροιας, που σχετίζεται με λήψη αντιβιοτικών και κολίτιδα. Ανευρίσκεται στα κόπρανα στο 5% των υγιών ενηλίκων και σε περίπου 30-70% των βρεφών.
Η κολίτιδα από το C. difficile προσβάλλει πιο συχνά ενήλικες που νοσηλεύονται σε νοσοκομεία και μονάδες μακροχρόνιας περίθαλψης που λαμβάνουν αντιβιοτικά, αλλά πρόσφατες μελέτες δείχνουν αυξημένα ποσοστά μόλυνσης και σε νέα υγιή άτομα χωρίς προηγούμενο ιστορικό χρήσης αντιβιοτικών ή νοσηλείας σε νοσοκομεία.
Κάθε χρόνο περισσότεροι από μισό εκατομμύριο άνθρωποι προσβάλλονται από κολίτιδα προκαλούμενη από C. difficile, αλλά τα τελευταία χρόνια έχουν αυξηθεί σημαντικά τα ποσοστά των πιο σοβαρών και δύσκολα αντιμετωπίσιμων λοιμώξεων.
Το C. difficile μεταδίδεται με την κοπρανοστοματική οδό. Ο μικροοργανισμός εισέρχεται στον οργανισμό του ανθρώπου με την κατάποση. Οι σπόροι μπορούν να επιβιώσουν για μακρές χρονικές περιόδους στο περιβάλλον και μπορεί να διεισδύσουν μέσα από τον όξινο φραγμό του στομάχου. Στο λεπτό έντερο οι σπόροι βλαστάνουν και μετατρέπονται στη βλαστική μορφή. Οι μικροοργανισμοί της εντερικής χλωρίδας, λειτουργούν ως προστατευτικός φραγμός απέναντι στο C. difficile. Ο φραγμός αυτός διαταράσσεται όταν η χλωρίδα αλλοιωθεί από παρατεταμένη λήψη αντιμικροβιακών.
Μετά τον αποικισμό του εντέρου από το C. difficile, ο μικροοργανισμός πολλαπλασιάζεται, παράγει και απελευθερώνει δύο εξωτοξίνες: την εντεροτοξίνη Α(TcdA) και την κυτταροτοξίνη Β(TcdB), οι οποίες αποτελούν τους κύριους λοιμογόνους παράγοντες του μικροοργανισμού. Οι τοξίνες αυτές συνδέονται με τα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου και ευθύνονται για την πρόκληση φλεγμονής, την έκκριση υγρού, βλέννης καθώς και την βλάβη του εντερικού βλεννογόνου.
H ΤcdΑ είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση φλεγμονωδών μεσολαβητών, όπως η IL-6 και η IL-8 από ανθρώπινα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα και IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α από μονοκύτταρα. Ωστόσο, η TcdB φαίνεται να είναι απαραίτητη για την μολυσματικότητα του μικροοργανισμού.
Oι τοξίνες κωδικοποιούνται από γονίδια tcdA και tcdB αντίστοιχα, τα οποία βρίσκονται στην περιοχή PaLoc, την ονομαζόμενη νησίδα παθογονικότητας. Η νησίδα παθογονικότητας είναι μία περιοχή μεγέθους 19 kb του γονιδιώματος του C. difficile όπου εδράζουν τα γονίδια: tcdA που κωδικοποιεί την τοξίνη Α, tcdB την τοξίνη Β, tcdC που επάγει την αρνητική ρύθμιση και tcdD που επάγει την θετική ρύθμιση.
Ορισμένα στελέχη C. difficile παράγουν μία επιπλέον τοξίνη, την δυαδική (ADP-ριβοσυλο-τρανσφεράση τοξίνη C. difficile τρανσφεράση CDT), η οποία αποτελείται από δύο πεπτιδικές αλύσους.
Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις πεπτιδικές αλύσους cdtA και cdtB βρίσκονται έξω από την νησίδα παθογονικότητας στην περιοχή CdtLoc.
Κλινικές εκδηλώσεις
- Διάρροια: Αποτελεί το συνηθέστερο σύμπτωμα της λοίμωξης. Μπορεί να είναι ήπια έως μέτρια, συνήθως δεν είναι αιματηρή και μπορεί να συνοδεύεται από κοιλιακό άλγος. Τα συμπτώματα αρχίζουν κατά τη διάρκεια ή αμέσως μετά τη λήψη αντιβιοτικών, αλλά μερικές φορές μπορεί να καθυστερήσουν για αρκετές εβδομάδες. Η διάρροια συνήθως υποχωρεί με τη διακοπή των αντιβιοτικών.
- Κολίτιδα: Η εκδήλωση αυτή χαρακτηρίζεται από πυρετό, κακουχία, μεγάλου όγκου υδαρείς κενώσεις, με ίχνη αίματος, ναυτία, ανορεξία, κοιλιακό άλγος και λευκοκυττάρωση. Η εικόνα στη σιγμοειδοσκόπηση είναι εικόνα ερυθηματώδους κολίτιδας, χωρίς ψευδομεμβράνες.
- Ψευδομεμβρανώδης κολίτιδα: Σοβαρή εικόνα της λοίμωξης με κοιλιακό άλγος, πυρετό και σοβαρή διάρροια, που μπορεί να είναι αιματηρή. Αύξηση των λευκών αιμοσφαιρίων και υπολευκωματιναιμία, σε σοβαρά πάσχοντες με μεγάλες απώλειες πρωτεΐνης. Στη σιγμοειδοσκόπιση έχουμε εικόνα κολίτιδας με σχηματισμό ψευδομεμβρανών και εμφάνιση πλακών, διαμέτρου 2-10 mm διάσπαρτες στον ορθοκολικό βλεννογόνο.
- Ειλεός–Τοξικό μεγάκολο: Η μορφή αυτή της λοίμωξης παρουσιάζεται σε περίπου 3% των ασθενών και περιλαμβάνει σοβαρές επιπλοκές, όπως παραλυτικό ειλεό, τοξικό μεγάκολο εως και διάτρηση του κόλου.
Παράγοντες κινδύνου
- Ηλικία ≥65 ετών (x20 φορές)
- Ανοσοκαταστολή
- Αντιόξινα → PPIs.
- Εντερική διατροφή
- Φλεγμονώδης νόσος του εντέρου
- Προηγηθείσα χειρουργική στο γαστρεντερικό
Τα αντιβιοτικά που συνδέονται με την πρόκληση της λοίμωξης από το κλωστηρίδιο είναι η κλινδαμυκίνη, οι τετρακυκλίνες, οι κινολόνες, οι κεφαλοσπορίνες και οι μακρολίδες.
Διάγνωση
• Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας (CCTA) Η μέθοδος αποτελεί την“gold standard”εργαστηριακή μέθοδο διάγνωσης της λοίμωξης από C. difficile με υψηλή ευαισθησία 97-100% και ειδικότητα 85-100%. Με την μέθοδο ελέγχεται η παρουσία της τοξίνης Β. Κατά την δοκιμασία τα κόπρανα διηθούνται και ενοφθαλμίζονται πάνω σε μία μονοστιβάδα, μίας κυτταρικής καλλιέργειας, η οποία στη συνέχεια εξετάζεται για εμφάνιση κυτταρικών αλλοιώσεων, που οφείλονται στην τοξίνη Β. Οι κυτταρικές αλλοιώσεις αξιολογούνται σε 24 και 48 ώρες.
• Τοξινογόνος καλλιέργεια (TC) Η τοξινογόνος καλλιέργεια θεωρείται μέθοδος αναφοράς στη διάγνωση της λοίμωξης από C. difficile, καθώς έχει αυξημένη ευαισθησία στην ανίχνευση τοξινογόνου C. difficile. Αρχικά τα στελέχη C. difficile απομονώνονται και αναπτύσσονται σε εκλεκτικό θρεπτικό υλικό κατόπιν επώασης σε αναερόβιες συνθήκες στους 35-37ºC για 48 ώρες. Σε ένα δεύτερο στάδιο, οι αποικίες ελέγχονται για την παραγωγή τοξινών χρησιμοποιώντας διάφορες κυτταρικές σειρές. Τα απομονωθέντα στελέχη καλλιεργούνται εκ νέου σε ζωμό και το υπερκείμενο διηθείται και προστίθεται σε καλλιέργεια κυτταρικής σειράς. Η κυτταροπαθογόνος δράση αξιολογείται και εξουδετερώνεται με αντιτοξίνη.
• Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Εμπορικά διαθέσιμες εξετάσεις ELISA μπορούν να ανιχνεύσουν την τοξίνη TcdA μόνη της ή και τις δύο TcdA και TcdB με ευαισθησία 75-85% και ειδικότητα 95- 100%.
• Αναερόβια καλλιέργεια Η καλλιέργεια αποδεικνύει την παρουσία του C. difficile στα κόπρανα. Τα κόπρανα επωάζονται σε εκλεκτικά υλικά υπό αναερόβιες συνθήκες, για 2-5 ημέρες. Τα θρεπτικά υλικά διευκολύνουν την ανάπτυξη του C. difficile, ενώ αναστέλλουν την ανάπτυξη της χλωρίδας.Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιείται είναι το CCFA( Cycloserine, cefoxitin, fructose agar). Οι αποικίες αναγνωρίζονται από την χαρακτηριστική μορφολογία τους, οσμή κοπριάς αλόγου και τον κίτρινο – πράσινο φθορισμό.
• Μοριακές μέθοδοι Οι μοριακές μέθοδοι παρέχουν ταχεία ανίχνευση του C. difficile με υψηλή ευαισθησία.
Οι κύριες μέθοδοι ανάλυσης του γονοτύπου για το C. difficile είναι οι ακόλουθες:
–PCR ribotyping – ριβοτυποποίηση.
Η μέθοδος εκμεταλλεύεται τις διαφορές στις περιοχές μεταξύ των 16S και 23S του ριβοσωμικού RNA, με τη χρήση ειδικών εκκινητών, που κωδικοποιούν αυτές τις περιοχές του RNA.Η ηλεκτροφόρηση σε γέλη αποκαλύπτει αλληλουχίες DNΑ που διαφοροποιούν τα στελέχη. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται πολύ συχνά στην Ευρώπη.
–Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) – Παλμική ηλεκτροφόρηση σε γέλη
Η μέθοδος χρησιμοποιεί ένα ένζυμο, που κόβει το γονιδίωμα του βακτηρίου, με αποτέλεσμα να προκύπτουν μεγάλα θραύσματα DNA, τα οποία στη συνέχεια διαχωρίζονται σε γέλη πολυακρυλαμιδίου.Τα θραύσματα του DNA ανάλογα με το μέγεθός τους μεταναστεύουν σε ποικίλες αποστάσεις μέσω της γέλης και οπτικοποιούνται με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως στις ΗΠΑ.
–Multilocus variable number tandem repeat analysis (MLVA)
H MLVA είναι μία μέθοδος καταμέτρησης του αριθμού των επαναλαμβανόμενων αλληλόμορφων στο γονιδίωμα του μικροοργανισμού. Απαιτεί ακριβό εξοπλισμό και επιτρέπει αξιόπιστη ανίχνευση του C. difficile και μπορεί να βοηθήσει σε επιδημιολογικές έρευνες.
–Multilocus sequence typing (ΜLST)
H MLST είναι παρόμοια μέθοδος με την MLVA. Είναι μία αλληλουχία νουκλεοτιδίων που βασίζεται στον χαρακτηρισμό του πολυμορφισμού των αλληλόμορφων. Τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί μία MLST για το C. difficile που επιτρέπει την ταχεία τυποποίηση απευθείας στο DNA που εξάγεται από τα κόπρανα χωρίς καλλιέργεια.
–Τoxinotyping
Το C. difficile παρουσιάζει μεγάλη μεταβλητότητα στην περιοχή PaLoc η οποία κωδικοποιεί τους δύο κύριους λοιμογόνους παράγοντες, τις τοξίνες TcdA και TcdB. Συγκεκριμένα, έχουν αναγνωριστεί 31 διαφορετικοί τοξιγονικοί τύποι (Ι με ΧΧΧΙ) που παρουσιάζουν διαφορές στην περιοχή PaLoc. Η μέθοδος Toxinotyping βασίζεται στην RFLP-PCR και χρησιμοποιείται για την διαφοροποίηση στελεχών C. difficile με βάση αλλαγές στα γονίδια των τοξινών σε σύγκριση με ένα αρχικό στέλεχος αναφοράς.
–Next Generation Sequencing (Συνολική αλληλούχιση του γονιδιώματος)
Η τεχνική συνολικής αλληλούχισης του γονιδιώματος προσφέρει τη δυνατότητα χαρτογράφησης ολόκληρου του γονιδιώματος του C. difficile και χρησιμοποιείται για ερευνητικούς σκοπούς. Μέσω της τεχνικής αυτής δίνεται η δυνατότητα για την επεξεργασία μεγάλου όγκου δεδομένων όπως παραγόντων που αφορούν την μολυσματικότητα, τη γενετική συγγένεια διαφόρων στελεχών του μικροοργανισμού και την εντόπιση πιθανών επιδημιών.
Πηγές
https://hms.org.gr/wp-content/uploads/2017/07/Issue-62-02_Chasabalioti.pdf
